一、实验原理：

    利用标记技术将酶标记到抗体（抗原）上，使待检物中相应的抗原（抗体）与酶标记抗体（抗原）发生特异性反应。在遇到相应的酶底物时，酶能高效、专一催化、分解底物，生成有颜色的产物。根据颜色的深、浅、可以判断待检物中有无特异的抗原（抗体）以及量的大小。该方法可对待检样品进行定性和定量分析；同时具有微量、特异、高效、经济、简便等优点，因此是一种广泛应用于生物和医学领域的微量测定技术。

    目前使用的酶联免疫检测方法很多，其种类按检测目的可分为：

    间接法——用于测定抗体

    双抗体夹心法——主要用于测定大分子抗原

    竞争抑制法——主要用于测定小分子抗原

    本实验以血清IgE的检测为例学习双抗体夹心法。

ELISA的原理图

血清lgE的检测

二、实验材料

酶标板（聚苯乙烯微量板）

马抗人IgE抗体—IgG（购自北京中山公司）

辣根过氧化物酶（HRP）标记的马抗人IgE抗体—IgG

待检血清

包被缓冲液： 0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠洗涤液(pH9.6)

封闭液：1%BSA溶液

反应终止液：5N H2SO4

三、实验方法

包被酶标反应板：加1:500马抗人IgE抗体（IgG），0.2ml/孔

    ↓37℃ 孵育2小时后洗涤3次，1分钟/次

封闭：加入1%BSA ，0.3ml/孔，4℃过夜

    ↓取出，洗涤同上

待检血清：加入不同稀释度的待捡血清，0.1ml/孔

    ↓37℃孵育40min后，洗涤同上

酶标记抗体：加入适当稀释度的酶标抗体，0.1ml/孔

    ↓37℃孵育40min后， 洗涤同上

底物：加入OPD（邻苯二胺）溶液，0.15ml/孔

    ↓室温30分钟

终止液：加入5N H2SO4 ，0.1ml/孔

    ↓

于20min内，用酶标仪测定各孔OD值，测定波长495nm

一、 实验结果

    用待测标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均吸收值的比值（P/N）

    表示，当P/N大于某一数值时（如2.1）判断为阳性，数值的大小依具体检测要求而定。

五、注意事项

1．实验时应分别设阳性对照与阴性对照孔，每一待检样品应平行作两份，以保证实验结果的准确性。

2．实验时，用羊血清、兔血清或BSA封闭以防止非特异性反应的发生。