一、基本原理

    正常人外周血中T细胞在体外能直接和绵羊红细胞(SRBC)结合形成玫瑰花样细胞团。这是因为人的T细胞膜上具有能和SRBC膜上的糖蛋白相结合的受体，称为E受体。已证实E受体是人T细胞所特有的表面标志，因此本试验可作为人外周血T细胞的鉴定和计数，同时作为人细胞免疫功能状态的一个检测指标，也是分离T细胞的常用方法之一。（本实验为示教内容）

二、实验材料

1. 肝素抗凝人外周血1ml。

2. 淋巴细胞分层液(见附录)2ml。

3. 0.5%SRBC悬液：将脱纤维的绵羊静脉血用Hank's液洗3次，再用Hank's液配制为含压积SRBC为0.5%的悬液(约含SRBC 8×107／m1)。

4. 经SRBC吸收的灭活的新生小牛血清(NBS)，取无菌NBS置56℃水浴经30分钟灭活，取已灭活的NBS 2体积，加入经洗涤后的压积SRBC l体积，混匀后置37℃温箱30分钟，离心沉淀，吸取上层血清即成。

5. Hank's液：pH7.4(见附录)。

6. 血球计数板、尖吸管、载玻片、瑞氏(Wright's)染液等。

三、实验方法

1. 取肝素抗凝血1ml加1ml Hank's液，混匀后用尖吸管将其加在2m1分层液上。

2. 离心2000rpm，30分钟，用尖吸管吸取血浆与分层液界面处富含淋巴细胞的悬液置于另一洁净试管中。

3. 用Hank's液以1000rpm，离心10分冲洗细胞两次，末次弃上清后再加入Hank's液1ml，混匀，用微量加样器吸取0.02ml加于0.38ml白细胞计数液中，在血球计数板上于低倍镜下计数，并根据下式算出每毫升细胞数。

细胞数／ml= EQ \F(4个大方格细胞总数,4) ×104×20(稀释倍数)

然后用Hank's液配制成107／ml细胞悬液。

4. 取107／ml细胞悬液0.1ml加0.1ml经SRBC吸收的灭活NBS，再加0.2ml 0.5%SRBC悬液，混匀，放37℃温箱5分钟，低速离心500rpm，5分钟，然后放4℃冰箱2小时或过夜。

5. 取出试管，轻轻使沉淀的细胞悬浮，用尖吸管取出一滴置于载玻片上，盖上已滴加瑞氏染液的盖玻片，于高倍镜下观察计数。

四、实验结果

计数200个淋巴细胞，凡结合3个SRBC以上者为E玫瑰花阳性细胞，求出百分率即为T细胞百分比。正常值为68±9.9%。

五、注意事项

    SRBC自绵羊体内取出后限在2周内使用。

图1 E花环形成试验。图中箭头所指为T淋巴细胞形成的E花环。